前交叉韧带重建术后的腱骨愈合是两种性质不同组织的相互连接融合的复杂过程，涉及到由软的移植物向硬的骨结构移行的过渡区域，腱骨愈合过程受多种因素的影响，其实质实际上是腱骨止点重新形成的过程。尽管前交叉韧带重建手术从宏观空间上恢复了韧带的连续性，但是想要获得长久稳定的关节则必须依赖于微观结构上良好的腱骨愈合。过度炎症引起的肌腱-骨界面瘢痕组织形成导致愈合强度不足，而死亡细胞的吞噬清除(efferocytosis)对巨噬细胞极化和炎症反应具有深远的影响。调节炎症微环境可能对前交叉韧带重建术(ACLR)患者有满意的疗效。

一：腱骨愈合界面炎症反应原因：

多形核白细胞(pmn)是炎症细胞的重要组成部分，在手术后的早期阶段，炎症细胞通常会在几秒钟内聚集到肌腱-骨界面，并吸引单核/巨噬细胞聚集和增殖。随后，大多数pmn经历快速凋亡，并开始积聚为未清除的凋亡细胞。然而，凋亡细胞含有大量自身抗原和细胞毒性化合物，从而加剧炎症反应，导致过度疤痕形成。

M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，炎症早期发挥重要作用；M2型巨噬细胞表达抑制炎症因子。主要在炎症后期发挥作用，抑制炎症反应，对组织进行修复和重构的作用。乳脂球表皮生长因子8（MFG-E8）是一种分泌的多功能糖蛋白，它是巨噬细胞识别凋亡细胞表面信号表达的桥梁，可以促进凋亡细胞和促炎细胞因子的清除，最终防止继发性损伤，MFG-E8可使骨髓巨噬细胞表型向M2极化转变，并通过诱导M2表型在组织愈合中发挥关键作用。

因此死亡细胞的吞噬清除对巨噬细胞极化和炎症反应具有深远影响；

二、体外实验、体内实验验证MFG-E8对巨噬细胞极化的影响

方法:从骨髓中获取骨髓源性巨噬细胞(bmdm)和多形核白细胞(PMNs)。比较乳脂球蛋白E8 (MFG-E8)与常规方法诱导的M1、M2巨噬细胞对巨噬细胞极化的影响。采用BMDMs和凋亡PMNs共培养系统评估清除的效率。通过大鼠ACLR模型，进一步研究MFG-E8通过调节巨噬细胞清除和极化在肌腱骨愈合中的生物学功能。

结果:成功分离BMDMs和pmn。与常规诱导方法相比，MFG-E8单独诱导巨噬细胞M1或M2极化不显著，但可以部分逆转M1巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。体外研究表明，适当剂量的MFG-E8可以显著促进巨噬细胞的吞噬效率，并随后增加M2极化。更重要的是，体内MFG-E8处理ACLR后，隧道周围新骨形成明显增加，连接界面更紧密，力学性能更好。

我们进一步证明MFG-E8在术后早期显著促进了移植肌腱与骨隧道交界面凋亡细胞的清除，并增加了M2巨噬细胞的数量。

结论:MFG-E8在组织学和生物力学上促进肌腱骨愈合，可能是通过巨噬细胞吞噬和M2极化调节炎症过程。

图1：

(A)收获趾长屈肌腱作为肌腱移植(B)加强肌腱移植端部，测量并记录长度(C)通过髌骨外侧脱位暴露膝关节，处理原生ACL (D)钻1.2 mm直径骨隧道。将针插入骨隧道(E)使用针帮助肌腱移植通过(F)肌腱移植成功从股骨隧道通过胫骨隧道(G)肌腱移植近端在股骨隧道出口位置用微型内扣固定(H)远端在胫骨隧道出口位置与骨皮质和周围骨膜固定

图2：

MFG-E8对巨噬细胞极化的影响(A)显微镜下观察IFN-γ + LPS、IL-4或MFG-E8刺激24 h后BMDMs的形态(B)流式细胞术分析BMDMs活化相关的表面标志物。与对照组(未处理)相比，在刺激后24小时，IFN-γ - LPS和IL-4组分别观察到cd86 +和cd206 +巨噬细胞的显著变化，而MFG-E8组则没有。(C)不同刺激24 h后，检测bmdm中炎症细胞因子mRNA的相对表达水平。 (D) IF染色显示MFG-E8能部分逆转M1巨噬细胞中iNOS或CD206的表达，但不能增加M2巨噬细胞中CD206的表达。

图3：

(A)不同剂量MFG-E8共培养2 h，吉姆萨染液荧光染色观察BMDMs对凋亡pmn的清除情况。绿色为pmn细胞，红色为BMDMs细胞。(B)荧光染色图像计算相对凋亡细胞清除指数。随着MFG-E8浓度的增加，对凋亡细胞清除的效率产生抛物线型的响应曲线。(C) western blot检测iNOS和CD206的表达水平。

图4：

MFG-E8对肌腱愈合的影响(A)显微ct扫描方案。选取胫骨骨骺下方共50片，制作roi三维图像(B)术后特定时间点不同治疗组隧道周围骨组织三维重建，MFG-E8组胫骨骺板下隧道周围骨组织明显增加，(C)通过micro-CT测量隧道周围骨组织微结构参数。(D) H&E染色评价骨隧道与肌腱移植物界面组织，量化肌腱-骨界面宽度。白色箭头表示Sharpey-like纤维。(E)采用Instron通用测试系统的生物力学试验方案(F)生物力学试验结果，通过载荷-位移曲线得到试件的最大破坏载荷和刚度。

图5：

MFG-E8对体内巨噬细胞吞噬和M2极化的影响(A)术后5和10天，对照组和MFG-E8组肌腱-骨界面iNOS和CD206的IHC染色。(B) TUNEL染色检测肌腱骨界面凋亡细胞(绿色)。条形图表示肌腱-骨界面周围tunel阳性凋亡细胞的定量。(C)应用western blot分析术后5、10 d肌腱-骨界面组织iNOS、CD206、IL-1β、IL-10的表达水平。(D)巨噬细胞吞噬和M2极化促进肌腱骨愈合的机制示意图。

结论：MFG-E8通过增强巨噬细胞的细胞清除作用和M2极化减弱炎症反应，最终导致炎症性骨损失减少，隧道周围新骨形成增加，改善骨整合。MFG-E8可以作为促进ACLR患者肌腱-骨愈合的新治疗策略。

三、思考

随着现代生物学的发展，新型生物材料、生物学方法为优化、促进腱骨愈合提供新思路,进一步分析腱骨愈合过程炎症反应机制及通路，在术后早期是否可通过药物治疗、局部注射MFG-E8-Like凝胶等抑制早期过度炎症反应，增加腱骨愈合强度，从而提高前交叉韧带重建术(ACLR)患者疗效，为ACLR患者肌腱-骨愈合的新治疗策略。

特别申明：本文献学习来源于：Geng R, Lin Y, Ji M, Chang Q, Li Z, Xu L, Zhang W, Lu J. MFG-E8 promotes tendon-bone healing by regualting macrophage efferocytosis and M2 polarization after anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Translat. 2022 May 11;34:11-21. doi: 10.1016/j.jot.2022.04.002. PMID: 35615640; PMCID: PMC9109120.